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96-1磁力搅拌器 在石蜡切片法实验中的应用简介

点击次数:2121 发布时间:2014-04-08

 一、目的要求:简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、 曙红染色法(简称H.E染色法),

  借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。

  二、实验用具:解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱(或恒温箱)、展片台(或烫板)、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。

  三、实验材料:蛙或小白鼠。

  四、实验内容:

  (一)药品:

  1、70%、80%、90%、95%酒精及无水酒精:

  95%以下的各级浓度酒精是用95%酒精加 蒸馏 水稀释而成。简单的稀释方法:所需稀释的浓度是多少,就量取多少毫升原浓度的酒精,再加 蒸馏 水至该酒精的原浓度即可。例如,配制70%酒精,就量取70ml95%酒精,然后加入25ml蒸馏水即成。

  2、固定液:

  常用的固定液有10%福尔马林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广,配方如下:

  苦味酸饱和水溶液 75ml

  福尔马林    25ml

  冰醋酸    5ml

  3、蛋白甘油:

  蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下:取一新鲜鸡蛋的蛋白,充分搅拌成雪花状泡沫,然后滤去泡沫,加入等量甘油,使用磁力搅拌器搅拌均匀,再加入一小粒麝香草酚防腐。因甘油粘度较大 所以须用大功率的磁力搅拌器。梅颖浦的96-1大功率磁力搅拌器非合适本实验。

  4、染色液:

  以H.E.染色法为例,需配制苏木精染液和曙红染液。

  ⑴、苏木精染液:苏木精是一种碱性染料,它可将染色质染成蓝紫色。配方有多种,现介绍Harris氏苏木精的配制:

  甲液: 苏木精     0.5 g

  95%酒精     5.0 ml

  乙液: 硫酸铝钾(或硫酸铝铵) 10g

  蒸馏水     100 ml

      0.25g

  冰醋酸     几滴

  先将甲液溶解,再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中,并加热使溶解,然后将两液混合煮沸,离开火焰后缓缓加入。冷却后过滤,加入几滴冰醋酸即成。

  ⑵、0.5%曙红酒精溶液:即0.5g曙红溶于100ml95%酒精中。 曙红是一种酸性染料,它可使多种细胞的细胞质染成粉红色或红色。

  5、盐酸酒精:

  盐酸酒精用于分色。配制方法是在100ml70%酒精中加入1ml盐酸。

  6、其它:

  二甲苯、切片石蜡、中性树胶等。

  (二)、操作步骤:

  进行组织学研究,必须把活的组织或器官制作成切片标本,以便在显微镜下进行观察。切片标本也就是利用组织的不同结构,经过染色后呈现出不同的颜色和不同的折光率而制作的。制片的方法众多,但基本要求是尽量保持结构的真相,切成薄的切片,应用不同的染色方法,使内部结构清晰易见。

  石蜡切片法是zui常用的一种制片法。其制作过程是:取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。现分述如下:

  1、取材和固定:

  固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态,使其与生活时相似,因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块,并快速投入固定液中。

  将蛙或小白鼠快速剪去头部,打开腹腔,用锐利的刀片割取小块组织(肝、肠等)。 组织块的大小以厚度不超过5mm 为宜。 然后, 将取下的组织块迅速投入Bouin氏固定液中。固定时间为数小时至24小时(需视组织块的大小而定)。

  2、冲洗:

  经固定的材料,可根据不同的固定液,分别用水或酒精冲洗,以洗去固定液,否则固定液留在组织会有碍染色.

  用Bouin氏液固定的材料,可直接移入70%酒精中,多换几次酒精,直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液,以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无妨碍。

  浸洗后的材料若暂时不制片,可保存于70%酒精中。

  3、脱水:

  柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的,故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织,以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的,因此,在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去,这一步骤即为脱水。

  常用的脱水剂是酒精。脱水时,先从低浓度的酒精开始,然后,递增浓度,直至无水酒精。具体方法是,将材料经70%酒精→80%酒精→95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(Ⅱ),各级酒精1-2小时。脱水应彻底,否则材料不能透明,影响石蜡的浸入,致使难以切片。

  4、透明:

  酒精与石蜡不能混和,因此,脱水后的材料在浸蜡前,还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精,又能溶解石蜡,以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。

  将脱水后的材料经1:1无水酒精与二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),各级时间为0.5-2小时,务使组织达到透明为止。

  5、浸蜡:

  将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂,而使石蜡渗入整个组织,获得一定的硬度和韧度,以便切成薄的切片。

  先将装有56-58℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化,并使熔蜡箱的温度保持恒定(约58℃),切勿太高或太低。 然后将透明了的材料放入蜡杯(Ⅰ)→蜡杯(Ⅱ)→蜡杯(Ⅲ)。浸蜡时间视材料大小而定,一般总的浸蜡时间为2-4小时左右。

  6、包埋:

  将浸蜡后的材料包埋于石蜡中,并使它凝固成蜡块,这一过程称为包埋。

  包埋前,视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒,作为包埋的容器。纸盒折法如下:先折1、2线,次折3、4线,然后使a、b两折重叠,向外折出5线;同法折出6线,再折c线。zui后依同法折出7、8线及d线即成。

  将纸盒盛满已熔化的石蜡,随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中,应注意切面朝下,位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中,待石蜡表面凝结后,将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后,拆去纸盒即成蜡块。

  7、切片:

  切片前,先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形,否则切出的

  蜡带弯曲不直,或无法连成带状。

  将修整后的蜡块粘在小木块上,小木块装在切片机上,以待切片。

  在旋转式切片机上将蜡块切成4-8um厚的薄片。切下的薄片连。蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带,放在蜡带盒内备用。

  8、贴片或烤片:

  将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上,用手指涂匀,并加几滴蒸馏水于载玻片上。 将蜡带按要求切成适当长度的蜡片,然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上,再把载玻片放在展片台上(温度为45℃左右)。蜡片受热后即慢慢展平。待完全展平后,用解剖针将切片位置拨正,倾去载玻片上的余水后,将其放在烤片盒中,置于50℃左右 恒温箱 内烤干。

  9、染色:

  染色剂多为水溶液,故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多,以H.E.染色法而言有下列步骤:

  ⑴、脱蜡:将烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中,各为5min, 以溶去切片上的石蜡。

  ⑵、复水:是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程,即将二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入无水酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水,各级中停留1-5min。

  ⑶、染色:

  ①、将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5-10min,使细胞核着色。

  ②、用自来水洗去切片上残余的染液。

  ③、用1%盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色,而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片,使分色适度。

  ④、入1%氨水或自来水浸洗,使之蓝化。

  ⑤、在蒸馏水中浸片刻。

  ⑥、切片入70%→80%→90%各1-2min。

  ⑦、入0。5%曙红酒精溶液中染色2-5min,使细胞质着色。

  10、脱水:

  切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(Ⅱ),各级中停留1-5min。

  11、透明:

  切片入1:1无水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),各级停留1-5min。

  12、封藏:

  将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出,用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶,然后,用镊子加盖盖玻片。

  切片封好后,放在切片托盘上待干燥,即可用不观察。

  染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。

  (三)、注意事项:

  1、制片是一个连续的操作过程,往往要连续几天才能完成,因此,事先一定要制订工作日程计划,应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突,也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间,给工作带来不必要的损失。

  2、制片的各个步骤都是互相关联的,如脱水不彻底就会影响到透明的程度,以至影响蜡块的质量。为此,必须对任何一个步骤,都要细致、严格进行操作。

  3、通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的,因此,应倍加爱护,不要损坏。

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